تعیین توالی کل اگزوم

تعیین توالی کل اگزوم و تعیین توالی کل ژنوم چیست؟

تعیین ترتیب قرارگیری بلوک‌های سازنده DNA (نوکلئوتیدها) در کد ژنتیکی یک فرد را تعیین توالی DNA گویند که سبب پیشرفت مطالعات ژنتیک شده و همچنین تکنیکی است که برای تست ناهنجاری‌های ژنتیکی استفاده می‌شود. دو روش تعیین توالی تمام اگزوم و تعیین توالی تمام ژنوم روز به روز بیشتر در خدمات درمانی و تحقیقاتی برای شناسایی تغییرات ژنتیکی استفاده می‌شوند، هر دو روش بر فناوری‌های جدیدی مبتنی هستند که اجازه تعیین توالی سریع مقادیر بزرگی از DNA را می‌دهد. این رویکرد‌ها را نسل جدید تعیین توالی (NGS یا Next Generation Sequencing) می‌نامیم. 

فناوری تعیین توالی اصلی که آنرا تعیین توالی سنگِر (Sanger Sequencing)  می‌نامیدند (از روی نام کسی که آن را توسعه داد یعنی فریدریک سنگر)، موفقیتی عظیم بود که به دانشمندان کمک کرد کدهای ژنتیک انسان را تعیین کنند اما زمان گیر و هزینه بر بود. روش سنگر اتومات و سریعتر شده و هنوز هم برای تعیین توالی قطعات کوچک DNA در آزمایشگاه‌ها استفاده می‌شود، اما تعیین توالی DNA  یک شخص (که آن را ژنوم فرد می‌گویند) با این روش سال‌ها زمان می‌برد. تعیین توالی نسل جدید  این فرایند را سرعت بخشید (تعیین توالی کل ژنوم انسان چند روز تا چند هفته طول می‌کشد) در عین اینکه هزینه آن را کاهش داد. 

با تعیین توالی نسل آینده، اکنون تعیین توالی مقادیر بزرگی از DNA ، برای مثال تمام قطعات DNA یک فرد که دستورالعمل‌هایی برای ساخت پروتئین‌ها فراهم می‌کند امکان پذیر است. این قطعات را اگزون می‌نامند که تصور می‌شود یک درصد از ژنوم یک فرد را تشکیل دهد. در مجموع تمام اگزون‌های یک ژنوم را اگزوم می‌نامیم و روش تعیین توالی آن را تعیین توالی تمام اگزوم می‌گویند. این روش اجازه شناسایی اختلافات در مناطق کدکننده پروتئین را نه تنها در چند ژن انتخابی بلکه در همه ژن ها امکان پذیر می کند. از آنجا که بیشتر جهش‌های شناخته شده‌ی بیماری زا در اگزون‌ها رخ می‌دهد، تصور می‌شود که تعیین توالی سراسری اگزوم برای شناسایی جهش‌های احتمالی بیماری زا روش کارایی باشد. 

اما محققان دریافتند که تغییرات DNA در خارج از اگزون‌ها نیز بر فعالیت ژن‌ها و تولید پروتئین‌ها اثر می‌گذارند و منجر  به ناهنجاری‌های ژنتیکی می‌شوند - تغییراتی که در تعیین توالی سراسری اگزوم از قلم می‌افتند. روش دیگری به نام تعیین توالی سراسری ژنوم، ترتیب تمام نوکلئوتیدها را در DNA  فرد تعیین کرده و می‌تواند تغییرات را در هر بخشی از ژنوم مشخص کند. 

در حالیکه در تعیین توالی سراسری ژنوم و اگزوم نسبت به تعیین توالی ژن‌های انتخابی، تغییرات ژنتیکی بسیار بیشتری قابل شناسایی است، معناداری بسیاری از این اطلاعات نامشخص است. از آنجا که تمام تغییرات ژنتیک بر سلامت اثر نمی گذارد، فهمیدن اینکه کدام تغییرات شناسایی شده در بیماری مد نظر دست دارد دشوار است. گاهی یک تغییر شناسایی شده با ناهنجاری ژنتیکی متفاوتی همراه است که تاکنون تشخیص داده نشده (این موارد را یافته‌های اتفاقی یا ثانویه می‌نامند). 

تعیین توالی سرتاسری ژنوم و اگزوم علاوه بر کاربرد بالینی برای تحقیقات نیز روش‌های ارزشمندی محسوب می‌شوند. مطالعات مستمر توالی‌های ژنومی و اگزومی به تعیین ارتباط تغییرات ژنتیکی جدید با بیماری‌ها و مشارکت آنها به تشخیص در آینده کمک می‌کند.

یافته‌های ثانویه‌ی یا اتفاقی حاصل از تست ژنتیک چیست؟

یافته‌های ثانویه، نتایج تست‌های ژنتیک در مورد تغییرات ژن هایی هستند که ارتباطی با هدف اولیه ما از تست ندارد. وقتی پزشک معالج برای کشف علت ژنتیکی یک بیماری خاص دستور یک تست ژنتیکی را می‌دهد، آن تست اغلب یک یا چند ژنی را تعیین توالی می‌کند که به نظر می‌رسد احتمالا با چندین نشانه و علائم آن شخص ارتباط داشته باشد. اما اگر علائم و نشانه‌های آن شخص علت ژنتیکی خاصی نداشته باشد، پزشک معالج دستور تستی می‌دهد که تمام قطعات DNA یک فرد که حاوی دستورالعمل‌ ساخت پروتئین است (به نام اگزوم) یا تمام بلوک‌های سازنده DNA فرد (نوکلئوتیدها) که آن را ژنوم می‌نامیم تعیین توالی شود. این تست‌ها را  به ترتیب تعیین توالی کل اگزوم یا تعیین توالی کل ژنوم می‌نامیم.

با انجام تعیین توالی کل ژنوم و اگزوم نسبت به تعیین توالی یک یا چند ژن به تنهایی، تغییرات ژنتیکی بسیار بیشتری قابل شناسایی هستند. گاهی تست تغییراتی را پیدا می‌کند که با یک بیماری به جز آنچه که تست برای آن انجام شده مرتبط است. این نتایج را یافته ثانویه می‌خوانند. برخی افرادی که یافته‌های ثانویه دارند هنوز هیچ یک از علائم و نشانه‌های مرتبط با بیماری را نشان نداده اند، اما در آینده در معرض ریسک ایجاد آن بیماری قرار دارند. برای مثال فردی با یک ژن تغییر یافته BRCA1، که با ریسک بالای سرطان پستان و تخمدان مرتبط است، شاید سرطان نداشته باشد. فرد دیگری با یافته‌های ثانویه ممکن است بیماری‌های ژنتیکی شناخته شده ای مانند کلسترول بسیار بالا داشته باشد، اما جواب‌هایی بگیرد که نشان می‌دهد یک علت ژنتیکی برای این بیماری وجود دارد مانند تغییری در ژن LDLR.  

در سال 2013 (و مجددا در سال 2017)، کالج ژنومیک و ژنتیک پزشکی امریکا (ACMG) توصیه کرد که تمام آزمایشگاه‌های انجام دهنده‌ی تعیین توالی کل اگزوم و ژنوم، یافته‌های ثانویه و همین طور هر نوع تغییری که مرتبط با هدف اولیه تست باشد را در گزارش بگنجانند. ACMG لیستی از 59 ژن را که با نوعی از بیماری‌ها، از سرطان تا بیماری‌های قلبی مرتبط هستند پیشنهاد کرد. این 59 ژنی که برای آنها یافته‌های ثانویه گزارش شده انتخاب شدند زیرا آنها با بیماری‌هایی مرتبط هستند که مشخصه‌های بالینی قابل تعریف، احتمال تشخیص زودهنگام، یک تست ژنتیکی بالینی قابل اطمینان و درمان یا مداخلات موثری دارند. هدف گزارش این یافته‌های ثانویه به یک فرد تامین منافع پزشکی او با پیشگیری یا مدیریت بهتر وضعیت سلامت است. مشخص شده که این تغییراتِ گزارش شده سبب بیماری می‌شوند. تغییراتی که اهمیت آنها شناخته شده نیست، یعنی دست داشتن آنها در بیماری در حال حاضر روشن نیست گزارش نمی شوند. 

اطلاعاتی که توسط یافته‌های ثانویه فراهم می‌شود می‌تواند بسیار مهم باشد زیرا به پیشگیری از بروز یک بیماری کمک کرده و یا اگر بیماری یا از قبل وجود داشته باشد یا بروز کند مدیریت علائم و نشانه‌ها را راهنمایی می‌کند. اما همانند هر نوع تشخیص پزشکی، خبر یک مشکل سلامت احتمالیِ غیر منتظره می تواند منجر به هزینه و استرس‌های سلامت بیشتری برای افراد و خانواده‌هایشان شود. بر مبنای یافته‌های ثانویه، باید تست‌های بیشتری برای تایید نتایج انجام شود، همچنین تست‌های غربالگری یا مراقبت‌های پیشگیرانه توصیه می‌شود. افرادی که تعیین توالی سرتاسری ژنوم و اگزوم انجام می‌دهد می‌توانند انجام آنالیز آن 59 ژن مربوط به یافته‌های ثانویه را رد کرده و جواب آن را نگیرند. از آنجا که تعیین توالی سرتاسری ژنوم و اگزوم بسیار رایج است، برای افراد مهم است که بفهمند چه نوع اطلاعاتی از آن می‌فهمند و چگونه بر مراقبت‌های پزشکی شان تاثیر می‌گذارد. 

انواع آزمایش اگزوم

در طی سالهای اخیر آزمایشگاه های بسیار زیادی در سرتاسر دنیا شروع به ارائه سرویس های تععین توالی اگزوم به بیماران و خانواده های آنها نموده اند. از اینرو این آزمایشگاه ها نام های تجاری بسایر متنوعی هم برای آزمایش های خود انتخاب کرده اند ولی نکته ایکه باید به آنها توجه داشت این است که تمامی آزمایش های اگزوم (از هر نام تجاری و برند خارجی) مشابه هستند و در اکثر موارد بیش از 98 درصد همپوشانی بین نتایج آزمایشگاه های مختلف دیده می شود. آزمایشگاه مندل با تکیه بر تجربه چندین ساله خود در زمینه انجام آنالیز های بیوانفورماتیک و با در اختیار داشتن چندین سرور و سوپر کامپیوتر قدرتمند از سال 1394 به صوت مستقل و بدون نیاز به ارسال نمونه به خارج از کشور (که باعث کاهش چشمگیر هزینه نهایی آزمایش می شود) تا کنون به بیش از 2000 خانواده بیمار سرویس های تشخیصی را ارائه نموده است و همین موضوع سبب شده تا یکی از کامل ترین پایگاه های داده ژنتیکی جمعیت ایرانی در این آزمایشگاه شکل بگیرد که همین پایگاه داده به انجام هر چه دقیق تر آنالیز داده ای بیماران جدید کمک می کند.

در مجموع آزمایش اگزوم به چندین حالت مختلف انجام می شود:

1- آزمایش اگزوم فقط برای فر بیمار (Solo): در این حالت تشخیص بالینی اولیه ظن بسیار قوی بر روی یک یا چند بیماری مشخص دارد و همچنین نمونه فرد بیمار اولیه در دسترس هست و از این رو در مرحله اول آزمایش اگزوم بر روی فرد مبتلا انجام شده و در نهایت نتایج حاصله بر روی والدین این فرد (و یا سایر اعضای خانواده) مورد تایید قرار می گیرند.

2- آزمایش اگزوم زوجین (Dio): در این حالت نمونه فرد مبتلا در دسترس نیست و ظن بالینی و علائم موجود در پرونده بیمار نیز برای ارائه نظر بالینی قطعی کفایت نمی کند، لذا در این حالت توصیه می شود دو آزمایش اگزوم به صورت همزمان برای هر دوی زوجین انجام شود و نتایج دو نفر به صورت مقایسه ای مورد بررسی قرار بگیرد.

3- آزمایش اگزوم فرزند و والدین به صورت همزمان (Trio): در این حالت بر اساس یافته های بالینی نمی توان با اطمینان نوع بیماری و یا گروه بیماری را تعیین نمود و برای اجتناب از هر گونه ابهام در تفسیر نتایج توصیه میشود که نمونه فرزند به همراه پدر و مادر به صورت همزمان مورد انجام آزمایش اگزوم قرار بگیرند و نتایج حاصله به صورت مشترک مورد تفسیر قرار بگیرد. این آزمایش دقیق ترین نوع از آزمایش اگزوم بوده و وجود داده های پدر و مادر در کنار فرزند مبتلا کمک بسیار زیادی به تفسیر نتایج می نماید.

شرایط انجام آزمایش اگزوم:

• بهترین نوع نمونه خون تام در لوله EDTA می باشد.
• انجام مشاوره ژنتیک قبل از آزمایش و تکمیل فرم های مربوطه الزامی است.
• مدت زمان انجام آزمایش از 2 تا 5 ماه متغییر است.
• برای انجام آزمایش نیازی به ناشتا بودن وجود ندارد.
• بعد انجام مرحله اولیه ممکن است نیاز به جلسات مجدد مشاوره ژنتیک وجود داشته باشد.
• نتیجه اولیه در یک بازه زمانی بین 15 الی 30 روز بعد از نتیجه اولیه مورد تایید نهایی قرار خواهد گرفت (بدون اخذ هزینه مازاد).
• بسته به نتایج حاصله ممکن است نیاز به نمونه گیری از سایر اعضای خانواده نیز وجود داشته باشد.

محدودیت انجام آزمایش اگزوم:

• آزمایش بررسی اگزوم در بهترین حالت خود می تواند حدود 80 الی 85 درصد از کل جهش های انسان را شناسایی کند.
• با توجه به مورد فوق در نظر داشته باشید برای بخشی از بیماران هرگز نتیجه مشخصی شناسایی نخواهد شد.
• در مواردی نتیجه به دست آمده از آزمایش ممکن است با اطلاعات علمی موجود قابل تفسیر نباشد و نیاز به مراحل تکمیلی بیشتری وجود داشته باشد.
• هزینه زیاد این آزمایش از دیگر محدودیت های آن می باشد.
• برخی بیماری ها همانند اختلالات کروموزومی، SMA، دیستروفی دوشن، سندروم X شکننده و امثالهم با استفاده از آزمایش اگزوم قابل شناسایی نیستند.